Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
mục lục
danh mục các chữ viết tắt 8
ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis 8
bp Base pair 8
BSA Bovin serum albumin 8
DNA Deoxyribonucleic acid 8
CI Chloroform-isoamyl alcohol 8
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide 8
DAPI 4 6-diamidino-2-phenylindole 8
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate 8
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis 8
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 8
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 8
FISH Fluorescence in situ hydridization 8
MQ Mili-Q 8
MPN Most probable number 8
OD Optical density 8
PBS Phosphate-buffered saline 8
PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol 8
PCR Polymerase chain reaction 8
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid 8
RNA Ribonucleic acid 8
rRNA Ribosomal ribonucleic acid 8
SDS Sodium dodecyl sulfate 8
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm) 8
TE Tris-EDTA (đệm) 8
Taq Thermus aquaticus DNA 8
UV Ultraviolet 8
Mở đầu 1
Ch ơng 1- Tổng quan tài liệu 3
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM) 3
1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt 4
1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính 5
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II) 6
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) 6
1.2.Khử nitrate nhờ vi khuẩn 7
1.3. Vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 8
1.4. Cơ chế phân tử của quá trình oxy hóa Fe(II) và các gen liên quan 9
1.5. ảnh h ởng của ô nhiễm nitrate và thừa sắt trong nguồn n ớc sinh hoạt 12
1.5.1. ảnh h ởng của nitrate đến sức khỏe con ng ời 12
1.5.2. ảnh h ởng của thừa sắt đến sức khỏe con ng ời 14
1.6. ý nghĩa của việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền và tiềm năng ứng dụng của các
vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate 14
1.7. Các ph ơng pháp sinh học phân tử hiện đại đ ợc sử dụng trong các nghiên cứu về tính
đa dạng và cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn 15
1.7.1. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 15
1.7.2. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 16
1.7.3. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 16
Ch ơng 2 - Nguyên vật liệu và ph ơng pháp nghiên cứu 17
2.1. Nguyên vật liệu 17
2.1.1. Đối t ợng nghiên cứu 17
2.1.2. Hóa chất 18
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 18
2.2. Ph ơng pháp nghiên cứu 19
2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate 22
2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn 23
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng ph ơng pháp ARDRA 24
2.2.5. Ph ơng pháp điện di biến tính DGGE 25
2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 26
2.2.7. Ph ơng pháp FISH 27
Lai với đầu dò: 28
2.2.8. Định l ợng Fe(II), Mn(II) và nitrate 29
Ch ơng 3 - Kết quả và thảo luận 32
3.1. Xác định số l ợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi tr ờng sinh thái khác
nhau 32
3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE) 34
3.3.Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi tr ờng nghiên cứu bằng ph ơng pháp
FISH 35
3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu 37
3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu 38
3.6. Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
bằng ph ơng pháp ARDRA 40
3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng vi
khuẩn đại diện 43
Kết luận 49
h ớng nghiên cứu tiếp theo 50
Tài liệu tham khảo 51
Phụ lục 62
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
danh mục các chữ viết tắt
ARDRA Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis
bp Base pair
BSA Bovin serum albumin
DNA Deoxyribonucleic acid
CI Chloroform-isoamyl alcohol
CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide
DAPI 46-diamidino-2-phenylindole
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FISH Fluorescence in situ hydridization
MQ Mili-Q
MPN Most probable number
OD Optical density
PBS Phosphate-buffered saline
PCI Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol
PCR Polymerase chain reaction
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris-Acetic-EDTA (đệm)
TE Tris-EDTA (đệm)
Taq Thermus aquaticus DNA
UV Ultraviolet
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
Mở đầu
Sắt là một trong những kim loại phổ biến trên trái đất. Thông thờng sắt tồn tại
ở dạng Fe
2
O
3
ít tan trong nớc và có màu vàng nâu. Trong môi trờng pH trung tính,
dạng hòa tan trong nớc, Fe(II), chỉ tồn tại ở điều kiện không có oxy, ví dụ nh ở đáy
các thủy vực, nơi oxy hòa tan trong nớc đã bị các vi sinh vật hiếu khí sử dụng để
phân hủy các hợp chất hữu cơ. Với hiệu điện thế oxy hóa khử Fe(III)/Fe(II) tại pH 7
vào khoảng +200 mV, ion Fe(II) có thể trở thành nguồn điện tử cho các quá trình hô
hấp kỵ khí, điển hình là khử nitrate thành N
2
do một số nhóm vi khuẩn đảm nhiệm
(Straub và cs, 1996; Benz và cs, 1998; Weber và cs, 2006 c). Quá trình oxy hóa
Fe(II), khử nitrate đợc tóm tắt nh sau:
10 Fe
2+
+ 2 NO
3
+ 24 H
2
O = 10 Fe(OH)
3
+ N
2
+ 9 H
2
Trong tự nhiên, quá trình oxy hóa Fe(II) với chất nhận điện tử là nitrate chủ
yếu diễn ra ở ranh giới hiếu khí (có oxy) và kỵ khí (không có oxy) trong lớp trầm
tích ở đáy các thủy vực. Oxy hóa Fe(II) kết hợp với khử nitrate có thể đóng vai trò
quan trọng trong môi trờng ô nhiễm với nồng độ Fe(II) cao (do thiếu oxy) và nitrate
cao (do chất hữu cơ bị phân hủy tạo thành) (Weber và cs, 2006 c). Các loài vi khuẩn
với khả năng tiến hành phản ứng oxy hóa khử này có thể cùng một lúc thực hiện đợc
hai nhiệm vụ, thứ nhất là chuyển Fe(II) hòa tan trong nớc về dạng Fe(III) kết tủa, và
hai là loại bỏ nitrate, chuyển thành dạng N
2
không độc hại.
Vi khuẩn dùng ion Fe(II) làm nguồn cho điện tử để khử nitrate đợc phân lập
đầu tiên từ các lớp trầm tích ao, hồ nớc ngọt tại Bremen, Đức năm 1996 (Straub và
cs, 1996). Một số công trình nghiên cứu tiếp sau cho thấy sự có mặt khá phổ biển
của nhóm vi khuẩn này với mật độ khá cao (10
6
tế bào/g trầm tích) trong các điều
kiện môi trờng khác nhau, bao gồm cả nớc ngọt, nớc lợ và nớc mặn và tại nhiều vi
trí địa lý khác nhau trên thế giới (Straub và Buchholz-Cleven, 1998). Các loài vi
khuẩn phổ biến nhất trong nhóm này đợc biết đến hiện nay là các loài thuộc chi
Chromobacterium và Klebsiella (Benz và cs, 1998; Senko và cs, 2005; Weber và cs,
Chuyên ngành Vi sinh vật học
1
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
2006 b). Các nghiên cứu về nhóm vi khuẩn này ở châu Âu với điều kiện sinh thái
hoàn toàn khác biệt với nớc ta.
Hiện nay, ở Việt Nam cũng nh trên thế giới, tình trạng ô nhiễm các kim loại
nặng và nitơ trong nguồn nớc sinh hoạt và nớc thải đang là vẫn đề đợc quan tâm
hàng đầu. Nồng độ ammonium hay nitrate cao trong nớc uống cũng nh nớc thải có
thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng liên quan đến môi trờng sinh thái và sức khỏe
cộng đồng (Avery, 1999; Lundgerg và cs, 2004; Tricker và Preussmann, 1991).
Thừa sắt trong cơ thể đợc cho là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh về
thần kinh và ung th (Moon, 2008).
Các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu sinh thái vi sinh vật
đã có nhiều bớc tiến đáng kể trong những năm gần đây. Trong số các phơng pháp
đó, có thể kể đến PCR-DGGE và FISH (không cần phân lập và nuôi cấy) hay
ARDRA và giải trình tự gen (thông qua bớc phân lập và nuôi cấy) là các phơng
pháp hữu hiệu đợc sử dụng phổ biến trong đánh giá tính đa dạng, phân tích cấu trúc
di truyền các nhóm loài của các vi sinh vật trong các môi trờng sinh thái khác nhau.
Từ những thực tế kể trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Vi khuẩn oxy
hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: Tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng
với mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử
nitrate ở Việt Nam và tìm hiểu khả năng ứng dụng của chúng trong xử lý nguồn nớc
nhiễm ion sắt kim loại và các hợp chất chứa nitơ.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
2
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
Chơng 1- Tổng quan tài liệu
1.1. Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ vi khuẩn
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn oxy hóa Fe(II) (FOM)
Khái niệm vi sinh vật liên quan đến oxy hóa sắt có từ nửa đầu thế kỉ 19, khi
Ehrenberg cho rằng các quặng sắt có thể đợc hình thành do kết quả của hoạt động
sinh học. Vi khuẩn liên quan trực tiếp đến sắt oxit, Gallionella ferruginea, cũng đã
đợc ông mô tả một cách chi tiết (Ehrenberg, 1919). Trong suốt thời gian sau đó,
nhiều đối tợng vi sinh vật đã đợc sử dụng để chứng minh rằng vi khuẩn có khả năng
oxy hóa sắt ở pH trung tính ví dụ nh Leptothrix ochracea (Kỹtzing, 1919). Tuy
nhiên vào thời điểm đó các bằng chứng đa ra vẫn cha đợc hoàn toàn xác thực. Cũng
vào thời điểm này, Harder, một giáo viên địa chất ngời Mỹ đã công bố một công
trình nghiên cứu về vi khuẩn sắt (Harder, 1919), trong đó vi khuẩn đợc chứng minh
là một trong các yếu tố địa hóa của chu trình sắt. Những vi khuẩn mà Harder đề cập
này sau đó đợc phát hiện trong một vài môi trờng nớc ngọt và phơng pháp làm giàu
cũng đợc sử dụng để cung cấp các bằng chứng cụ thể về hình thức sinh trởng tự d-
ỡng vô cơ của nhóm vi khuẩn này. Tuy nhiên vào thời điểm đó, chủng đơn vẫn cha
phân lập đợc.
75 năm sau đó, nhiều nghiên cứu đã cung cấp các hiểu biết về tập tính của vi
sinh vật oxy hóa Fe(II) (FOM- Ferrous oxidizing Microbiology) cũng nh vai trò
quan trọng của chúng trong phản ứng địa hóa và ăn mòn sinh học. Mặc dù vậy số
chủng phân lập đợc còn giới hạn, do đó mức độ đa dạng, phân loại, hình thái cũng
nh sinh lý của nhóm vi khuẩn này vẫn cha đợc mô tả chi tiết (Emerson, 2000). Năm
1984, tổng quan của Ghiorse đã thảo luận nhiều vấn đề về pháp danh và phân loại
của nhóm vi khuẩn này (Ghiorse, 1984). Quá trình oxy hóa Fe(II) kỵ khí mới đợc
biết đến nhờ việc phân lập đợc vi khuẩn tía quang hợp không lu huỳnh, có khả năng
sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Widdel và cs, 1993). Tiếp sau đó, vào năm
1996 Straub và cộng sự lần đầu tiên phân lập đợc vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II),
khử nitrate (Straub và cs, 1996). Năm 1997 lần đầu tiên vi khuẩn vi hiếu khí ở pH
Chuyên ngành Vi sinh vật học
3
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
trung tính có khả năng oxy hóa Fe(II) đợc phân lập và mô tả đặc điểm bởi Emerson
và Moyer năm 1997 (Emerson và Moyer, 1997).
Cho đến nay nhiều nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn có khả năng oxy
hóa Fe(II) cho thấy chúng có mặt phổ biến ở hầu hết các môi trờng từ nớc ngọt, nớc
lợ đến nớc mặn, trong đất, nớc và trầm tích, ở pH acid đến pH trung tính với số lợng
tơng đối lớn (Ehrenreich và Widdel, 1994; Straub và cs, 1996, 1998; Emerson và
Moyer, 1997; Benz và cs, 1998; Heising và cs, 1999; Hauck và cs, 2001; Ratering
và Schnell, 2001; Edwards và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Weber và cs, 2006
b, c).
1.1.2. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình oxy hóa - khử sắt
Quá trình oxy hóa - khử giữa Fe(II) và Fe(III) (hình 1) có vai trò thiết yếu
trong chu trình sinh địa hóa môi trờng và là quá trình sinh địa hóa quan trọng có mặt
từ rất sớm trên trái đất. Fe(II) là thành phần của các dạng khoáng phổ biến nh
siderite (khoáng chất có chứa FeCO
3
), vivianite (Fe
3
(PO
4
)
2
.8H
2
O) hoặc Pyrite (FeS
2
)
trong môi trờng kỵ khí có tính acid yếu đến môi trờng trung tính (Straub và cs,
2001). Trớc khi phản ứng oxy hóa khử nhờ vi khuẩn đợc phát hiện ra thì cơ chế vô
sinh đã đợc cho là chi phối quá trình oxy hóa khử sắt trong môi trờng. Tuy nhiên,
đến nay thì rõ ràng là sự chuyển hóa sắt chủ yếu là do vi khuẩn điều khiển trong hầu
hết các điều kiện môi trờng. Nhiều loài vi khuẩn, kể cả vi khuẩn cổ, có khả năng sử
dụng thế oxy hóa khử của cặp Fe(II)/Fe(III) (+770 mV đối với môi trờng acid; +200
mV đối với môi trờng trung tính) và các cặp oxy hóa - khử khác để trao đổi điện tử,
tạo năng lợng. ở đây, Fe(II) đợc sử dụng nh là chất cho điện tử để cung cấp đơng l-
ợng khử cho các quá trình đồng hóa carbon thành sinh khối nhờ các vi khuẩn oxy
hóa Fe(II) trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí, còn Fe(III) có thể đợc sử dụng nh là
chất nhận điện tử cuối cùng trong điều kiện kỵ khí cho các vi khuẩn tự dỡng vô cơ
và tự dỡng hữu cơ khử Fe(III) (Weber và cs, 2006 a).
Mặc dù vai trò của quá trình chuyển hóa sắt nhờ vi khuẩn trong môi trờng là
rất lớn nhng những hiểu biết của chúng ta về sinh lý, sinh hóa của chúng vẫn còn
giới hạn. Hầu hết các nghiên cứu và công bố về quá trình oxy hóa Fe(II) đều tập
Chuyên ngành Vi sinh vật học
4
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
trung vào các vi khuẩn hiếu khí, a acid nh Thiobaccillus ferrooxidans (Temple và
Colmer, 1951; Yamanaka và Fukumori, 1995), là vi khuẩn phát triển trong môi tr-
ờng có pH 1-2 và tồn tại Fe(II) và Fe(III) ở dạng ion hòa tan. Tuy nhiên, ở pH trung
tính cơ chất và sản phẩm của quá trình chuyển hóa sắt lại ít hòa tan, điều này gây
khó khăn cho việc nghiên cứu (Straub và cs, 2001).
Hình 1. Chu trình sắt trong tự nhiên (Ehrlich và Newman, 2008). 1 - Vi sinh vật
trong môi trờng acid; 2 - Vi sinh vật kỵ khí ở môi trờng trung tính (khử nitrate,
quang hợp kỵ khí); 3 - Quá trình hóa học trong môi trờng trung tính với nồng độ O
2
cao; 4 - Quá trình hóa học; 5 - Quá trình sinh học; 6 - H
2
S từ vi sinh vật; 7 - +O
2
,
quá trình sinh học hoặc hóa học; 8 - +CO
3
2
, quá trình hóa học; 9 - chuyển H
+
, quá
trình sinh học hoặc hóa học; 10 - Quá trình sinh học hoặc hóa học.
1.1.3. Vi khuẩn hiếu khí oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính
Sự cạnh tranh của các vi khuẩn hiếu khí có khả năng oxy hóa Fe(II) (FOM)
với động học của quá trình oxy hóa vô sinh Fe(II) bằng O
2
đã đợc chứng minh là
góp phần hoàn thiện chu trình sắt trong môi trờng hiếu khí (Emerson và Moyer,
1997; Sobolev và Roden, 2001; Edwards và cs, 2003). Quá trình oxy hóa Fe(II) nhờ
vi khuẩn đi kèm với khử oxy ở pH trung trính và acid đã đợc biết đến trong hơn một
thế kỷ nay. ở thời điểm đầu vai trò của oxy hóa Fe(II) ở pH trung tính nhờ vi khuẩn
hiếu khí đã bị xem nhẹ vì phản ứng hóa học oxy hóa Fe(II) bằng oxy không khí xảy
ra rất nhanh. Cho đến nay, mức độ đa dạng của FOM trong môi trờng hiếu khí đã đ-
Chuyên ngành Vi sinh vật học
5
Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Tuyền - Cao học K16
ợc nghiên cứu chi tiết, các loài đợc phát hiện đều thuộc 3 chi Gallionella, Leptothrix
và Marinobacter (Kỹtzing, 1919; Ehrenberg, 1919). Một số FOM hiếu khí a pH
trung tính gần đây đã đợc xác định thuộc vào các phân lớp -, -, - Proteobacteria
(Edwaras và cs, 2003; Emerson và Weiss, 2004; Dhillon và cs, 2005; Rentz và cs,
2007).
1.1.4. Vi khuẩn quang hợp kỵ khí oxy hóa Fe(II)
Trong những khu vực có ánh sáng, Fe(III) có thể cũng đợc tạo thành thông
qua hoạt tính oxy hóa Fe(II) của vi khuẩn quang hợp có khả năng sử dụng Fe(II) nh
một nguồn cho điện tử để tạo các đơng lợng khử cho quá trình đồng hóa carbon vô
cơ (Weber và cs, 2006 a). Vi khuẩn quang hợp kỵ khí là vi khuẩn oxy hóa Fe(II)
bằng con đờng kỵ khí đợc biết điến đầu tiên (Widdel và cs, 1993). Vi khuẩn này phổ
biến đợc biết đến hiện nay thuộc các chi Chlorobium, Rhodobacter, Thiodictyon,
Rhodovulum, Rhodomicrobium (Ehrenreich và Widdel, 1994; Heising và Schink,
1998; Heising và cs, 1999; Straub và cs, 1999; Kappler và Newman, 2004; Miot và
cs, 2009). Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn quang hợp oxy hóa
Fe(II) không có khả năng sử dụng Fe(II) ở dạng khoáng mà chỉ có thể oxy hóa
Fe(II) ở dạng ion hòa tan (Kappler và Newman, 2004), do đó chúng chỉ đóng vai trò
nhỏ trong quá trình oxy hóa - khử sắt và sự phong hóa sắt trong môi trờng trên cạn.
1.1.5. Vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II)
Gần đây, việc xác định đợc các vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) đã lấp đầy chỗ
trống trong bức tranh tổng thế về chu trình oxy hóa - khử sắt nhờ vi sinh vật (Widdel
và cs, 1993; Straub và cs, 1996). Các bằng chứng gần đây cũng đã chỉ ra rằng vi
khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II) có thể đóng vai trò quan trọng trong chu trình oxy hóa -
khử sắt (Senn và Hemond, 2002; Straub và cs, 2004; Weber và cs, 2006 c), trong
chu trình sinh địa hóa đất, trầm tích, khoáng hóa, và quá trình cố định các chất
phóng xạ và kim loại nặng (Chaudhuri và cs, 2001; Weber và cs, 2001; Lack và cs,
2002; Weber và cs, 2006 c). Trong môi trờng không có oxy, quá trình oxy hóa
Fe(II) nhờ vi khuẩn đã đợc chứng minh là thờng đi kèm với quá trình khử
Chuyên ngành Vi sinh vật học
6
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét