- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli
(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản
xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng
rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây
viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS:
haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like
toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như
độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các
tạp chí khoa học ở Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng
nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, khơng
phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu khơng có các yếu tố độc lực khác.
Những dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe
mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu
tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, khơng phải tất cả STEC
đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
b. Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
* Shiga toxin
Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là
Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt).
Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính khơng phản ứng chéo với nhau là Stx1 và
Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị
B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA). Cả hai gen stxA và
stxB được định vị trên bacteriophage ơn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST)
của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm
chí nhiều dạng Stx2. Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv,
1998). Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người. Nhưng thỉnh
thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv,
1994). Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1
= Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997). Hầu hết những phương
5
pháp chẩn đốn phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC
(Cocolin và ctv, 2000).
* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể là
heat – stable enterotoxin (EAST1). Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa mà
plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC
khơng phải O157. Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã
hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994). Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc lực
thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E. coli có Stx âm tính và Ehly
dương tính là ngun nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và
ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được mơ tả trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều
dòng STEC. EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì khơng được biết, nhưng nó có thể
liên quan đến một số bệnh tiêu chảy khơng có máu thường xun được tìm thấy ở
những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế bào
ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Protein
intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing). Intimin gây tổn thương
dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám
chặt vào tế bào biểu mơ (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở
nhóm EPEC. Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là
vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của
STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin là Tir
(translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng LEE khơng chỉ là điều kiện
cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên, khơng phải tất
cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998).
Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngồi vi khuẩn (protein
intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng của
tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).
Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta cho
rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác. Dấu hiệu
sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là khơng thể lên men sorbitol hoặc
khơng tạo ra
β
- glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đốn STEC chỉ dựa vào
6
việc phát hiện E. coli khơng lên men sorbitol. O157:H7 và các serotype khơng phải
O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:H
NM
và
O113:H21 (WHO, 1994).
c. Nguồn lây nhiễm
STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều lồi động vật như trâu, bò, cừu, dê,
heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv,
1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Lồi động vật quan trọng nhất
trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi
thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong q trình giết
mổ (Butler, 1996).
STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang
người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là
thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là ngun nhân chủ yếu
(Keskimaki, 2001).
2.1.5.2. Nhóm EPEC
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955)
để chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
a. Đặc điểm
Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn
bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC khơng sản xuất độc tố
Shiga.
b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể
quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong
ni cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự hư
hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mơ.
Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V.
cholerae bám theo kiểu khơng chặt, khơng gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần thiết
cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc lực
cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae
hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei,
7
nhưng khơng hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thơng
thường.
c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường
miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi.
Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng
thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà ngun nhân có thể là do mất
các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số
lượng vi khuẩn đủ cao.
2.1.5.3. Nhóm ETEC
a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc
tố ruột kém chịu nhiệt (LT).
(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):
Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức
năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra.
LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau
khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên
động vật hay trong ni cấy tế bào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và
LT-II khơng có phản ứng chéo về mặt miễn dịch.
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là một
oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B
11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A
1
và peptide
A
2
liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên
kết chắc chắn với ganglioside GM
1
và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein
ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần
với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập
từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể
8
chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng ngun của yếu tố định vị
(colonization factor antigen – CFA).
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập
qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức
AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng
khơng hoạt động thành dạng hoạt động. Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh
chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mơ. Kết quả là kích thích
những tế bào mào ruột tiết ra Cl
-
một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl
bởi những tế bào nhung mao (villus). Đây chính là ngun nhân dẫn đến tiêu chảy dữ
dội (Nataro và Kaper, 1998).
- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn
vị A, nhưng khơng giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng
cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II khơng liên quan đến
bệnh trên người và thú.
(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó
giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa
và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả
hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy
trên transposon. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn
Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V. cholerae khơng phải O1. ST giống
50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo gần đây
cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngồi việc sản sinh ra STa, còn có thể sản
sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử
khoảng 2 kDa. STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli
phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân lập trên người.
Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người.
Thụ thể chính của STa là enzyme xun màng guanylate cyclase C (GC-C). STa
kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào.
Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl
-
và / hoặc ngăn cản sự hấp thu
NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy.
9
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài
chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Khơng như STa, STb gây ra
những tổn thương về mặt mơ học trên lớp biểu mơ ruột như mất tế bào nhung mao của
lớp biểu mơ ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc
dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp khơng đặc hiệu với màng tế bào chất trước
khi vào bên trong tế bào. Khơng gây ra sự tiết Cl
-
nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết
bicarbonat (HCO
3
-
). STb khơng làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích
thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb còn kích thích phóng thích PGE
2
và
serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng
tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992).
Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu
kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lơng trên
bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens).
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại
lơng hình que cứng, lơng hình que mềm dạng bó, lơng có cấu trúc mảnh mềm. Có ít nhất
20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid,
cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996). Tiểu đơn vị
cấu trúc lơng thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng ngun rất
mạnh.
b. Dịch tễ
Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em
thơi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của bệnh do
ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của
từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm khơng có biểu hiện triệu
chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi
liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ơ nhiễm ETEC trong mơi
trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC
trong thời kì thơi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do
ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là ngun nhân của hầu hết các trường hợp
bệnh.
10
Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ơ nhiễm là những
phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những
vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên
mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng
thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là ngun nhân chính gây
tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng
có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu chứng tiêu
chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở
những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển. Tiêu chảy trên du
khách thường là do thức ăn và nước uống bị ơ nhiễm.
c. Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50
giờ). Bệnh nhân tiêu chảy tồn nước, thường khơng có máu; một vài bệnh nhân có hiện
tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng cũng có
thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ
em thơi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm
cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì khơng sẵn có ở
những vùng nguy cơ cao; ngồi ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn
đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm
ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.
d. Phát hiện và chẩn đốn
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có
nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…
2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1. Ngun tắc
PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in vitro
cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn
(tạo dòng in vitro, khơng cần sự hiện diện của tế bào).
11
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA đơn,
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khn (trình tự DNA mẫu xét
nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều
kiện phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xi” (forward primer) và
primer “ngược” (reverse primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với
sợi DNA mẫu. Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đơi. Sự tổng hợp này
sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.
Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên
đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một
phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mơ tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó
multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol
online).
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA được
biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 -95
0
C
trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp
với khn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60
0
C tuỳ thuộc Tm
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.
Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72
0
C giúp DNA polymerase hoạt động tổng
hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA
nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.
* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng
đơi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo cơng thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2
n
Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa
12
* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài khơng xác định vì DNA
polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu
kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng khơng xác định. Tuy nhiên, ở chu
kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ
chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng
của trình tự đích được tính theo cơng thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2
n
– 2n) * x
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài khơng xác định sau chu kỳ 1 và 2
x : Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Số chu kỳ của phản ứng PCR
- Trong thực tế, khơng vượt q 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng PCR
diễn ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu
ban đầu.
+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
Các bản sao vừa tổng hợp khơng kết hợp với primer mà lại bắt cặp
với nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban đầu là
10
5
thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 10
2
– 10
3
thì số chu kỳ phải là 35 –
40.
Hình 2.1 Ngun lý của phản ứng PCR
13
Giai đoạn biến tính
(denaturation)
Giai đoạn ủ bắt cặp
(anealing)
Giai đoạn kéo dài
(elongation hay
extension)
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung
với trình thự base của hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp DNA. Việc
chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải đặc
trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên gen,
khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer ngược và cũng khơng có những
cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các primer tối
thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide).
Trình tự nằm giữa hai primer xi và ngược khơng q lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu
trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được
chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA polymerase
khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối q trình phản
ứng dưới sự hiện diện của Mg
2+
. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng
5’→3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-72
0
C.
Biến tính
94-95
0
C
Ủ bắt cặp
40-70
0
C
Kéo dài
72
0
C
Lặp lại n lần
Thời gian (phút)
Nhiệt độ (
0
C)
14
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét