Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne

ii
TÓM TẮT
BIỆN THỊ LAN THANH – Lớp DH02SH, Đại học Nông Lâm Tp. HCM.
Đề tài “Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo
đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne” dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Dung và
CN. Lưu Phúc Lợi được thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trung tâm phân
tích thí nghiệm hóa sinh và khu thực nghiệm khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp.
HCM.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên
cây dứa Cayenne.
Nội dung nghiên cứu gồm:
* Kiểm tra virus PMWaV-1 ở cây dứa in vitro được tái sinh từ đỉnh sinh trưởng
đã qua xử lý nhiệt ở 37
0
C trong thời gian 40 ngày và 50 ngày bằng kỹ thuật RT-
PCR.
* Khảo sát sự tăng trưởng của cây dứa in vitro sạch virus PMWaV-1 và các chồi
dứa nhân giống vô tính khác trong vườn ươm.
* Kiểm tra virus PMWaV-1 ở cây dứa in vitro và các chồi dứa nhân giống vô tính
khác sau 70 ngày trồng trong vườn ươm.
Các kết quả thu được:
* Tỉ lệ cây dứa in vitro sạch virus PMWaV-1 ở thời gian xử lý nhiệt 40 ngày là
77,78%; ở thời gian xử lý nhiệt 50 ngày là 88,89%.
* Cây dứa in vitro tăng trưởng chiều cao chậm hơn so với các chồi dứa nhân
giống vô tính khác.
* Chồi dứa tạo ra từ thân chẻ 4 có số lá nhiều nhất, kế đến là chồi dứa tạo ra từ
thân cắt khoanh, cây dứa in vitro, cuối cùng là chồi dứa tạo ra bằng cách giâm
lá.
* Sau 70 ngày trồng trong vườn ươm, 100% cây dứa in vitro được kiểm tra đều
sạch virus PMWaV-1, tỉ lệ nhiễm virus PMWaV-1 của các chồi dứa nhân giống
ngoài đồng là 14,81%.




iii
MỤC LỤC
TRANG

Lời cảm ơn i
Tóm tắt ii
Summary iii
Mục lục iv
Danh sách các bảng vii
Danh sách các hình viii
Danh sách các chữ viết tắt ix
Phần 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài 1
1.3. Giới hạn của đề tài 2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Đặc điểm thực vật học của cây dứa 3
2.2. Các nhóm dứa chính 4
2.2.1. Nhóm Cayenne 4
2.2.2. Nhóm Queen 4
2.2.3. Nhóm Tây Ban Nha 5
2.3. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam 5
2.4. Bệnh héo do virus 7
2.4.1. Tác hại 7
2.4.2. Nguyên nhân gây bệnh 8
2.4.3. Triệu chứng 8
2.4.4. Tác nhân lây truyền bệnh 9
2.4.5. Cách phòng trị 10
2.5. Phương pháp tạo cây sạch virus 11
2.5.1. Cơ sở của các phương pháp tạo cây sạch virus 11
2.5.2. Các phương pháp tạo cây sạch virus 11
2.6. Các phương pháp nhân giống dứa 14

iv
2.6.1. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô 14
2.6.2. Nhân giống bằng cách kích thích chồi ngủ phát triển 15
2.7. Gene hsp-70 của PMWaV 16
2.8. Một số phương pháp giám định virus trên thực vật 17
2.8.1. Phương pháp dùng kính hiển vi điện tử 17
2.8.2. Các phương pháp sinh học phân tử 17
2.9. Các phương pháp phát hiện PMWaV 20
2.10. Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam 20
Phần 3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Nội dung, thời gian và địa điểm 23
3.1.1. Nội dung 23
3.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23
3.2. Nội dung 1: Kiểm tra virus PMWaV-1 trên cây dứa in vitro tái sinh từ đỉnh
sinh trưởng đã qua xử lý nhiệt 23
3.2.1. Vật liệu 23
3.2.2. Hóa chất 24
3.2.3. Cách tiến hành 25
3.2.3.1. Ly trích RNA tổng số 25
3.2.3.2. Phản ứng RT-PCR 27
3.2.3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 28
3.2.3.4. Nhân giống cây dứa in vitro sạch virus PMWaV-1 trong phòng thí
nghiệm 29
3.3. Nội dung 2: Khảo sát sự tăng trưởng của cây dứa in vitro sạch virus PMWaV-1
và cây dứa được tạo ra bằng các phương pháp vô tính khác 30
3.3.1. Vật liệu 30
3.3.2. Cách tiến hành 30
3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi 33
3.4. Nội dung 3: Kiểm tra virus PMWaV-1 trên cây dứa Cayenne sau trồng 70 ngày
trong vườn ươm 33
3.4.1. Mẫu kiểm tra 33
3.4.2. Thiết bị, dụng cụ và cách tiến hành 33
Phần 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 34

v
4.1. Kết quả kiểm tra virus PMWaV-1 trên cây dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng
đã qua xử lý nhiệt 34
4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của cây dứa in vitro sạch virus PMWaV-1 so với các
cây dứa được tạo ra bằng các phương pháp nhân giống vô tính khác 35
4.2.1. Chiều cao 35
4.2.2. Số lá 37
4.3. Kiểm tra virus PMWaV-1 trên cây dứa Cayenne sau 70 ngày trồng trong
vườn ươm 39
Phần 5. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 41
5.1. Kết luận 41
5.2. Đề nghị 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC














vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG


TRANG
Bảng 3.1 Các mẫu lá của cây dứa in vitro tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV-1
bằng kỹ thuật RT-PCR 24
Bảng 3.2 Thành phần mix phản ứng RT-PCR 27
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 28
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra PMWaV-1 trên cây dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng
đã qua xử lý nhiệt 34
Bảng 4.2 Chiều cao chồi dứa sau 20 ngày trồng 35
Bảng 4.3 Chiều cao chồi dứa sau 30 ngày trồng 36
Bảng 4.4 Chiều cao chồi dứa sau 40 ngày trồng 36
Bảng 4.5 Số lá của chồi dứa sau 20 ngày trồng 37
Bảng 4.6 Số lá của chồi dứa sau 30 ngày trồng 38
Bảng 4.7 Số lá của chồi dứa sau 40 ngày trồng 38
Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV-1 ở các chồi dứa sau 70 ngày trồng trong vườn
ươm 39












vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Cây dứa Cayenne 7
Hình 2.2 Cây dứa bị bệnh héo đỏ đầu lá 8
Hình 2.3 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá 9
Hình 2.4 Rệp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp xám (D. neobrepes) 10
Hình 2.5 Sự cộng sinh giữa kiến đầu to (Pheidole megacephala) và rệp sáp 10
Hình 2.6 Phản ứng PCR 18
Hình 2.7 Phản ứng RT-PCR 19
Hình 3.1 Hom thân chẻ dọc trước khi giâm 30
Hình 3.2 Hom thân cắt khoanh trước khi giâm 31
Hình 3.3 Hom lá trước khi giâm 31
Hình 3.4 Chồi dứa sau 40 ngày giâm 32
Hình 3.5 Chồi dứa tách từ hom thân chẻ 4 32
Hình 3.6 Chồi dứa tách từ hom thân cắt khoanh 32
Hình 3.7 Chồi dứa tách từ hom lá 32
Hình 3.8 Cây dứa in vitro 32
Hình 3.9 Chồi dứa trồng trong vườn ươm 33
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR các mẫu cây dứa in vitro tái sinh từ đỉnh
sinh trưởng đã qua xử lý nhiệt 34
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR các mẫu dứa sau 70 ngày trồng trong
vườn ươm 40








viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PMWaV Pineapple mealybug – wilt associated virus
RT-PCR Reverse transcription – polymerase chain reaction
ELISA Enzyme – linked immunosorbent assay
TIBA Tissue blot immunoassay
PCR Polymerase chain reaction
cDNA Complementary deoxynucleic acid
DNA Deoxynucleic acid
RNA Ribose nucleic acid
HSP Heat – shock protein
PCV Pineapple closterovirus
ĐST Đỉnh sinh trưởng
l Micro lít
mg Mili gam
cs Cộng sự
TQ Trung Quốc
TL Thái Lan
LĐ Lâm Đồng
Tm Melting temperature
dNTP Deoxy nucleotide triphosphate












1

Phần 1. GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề
Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng trên thế
giới bởi hương vị đặc trưng và giàu dinh dưỡng (vitamin, acid hữu cơ…). Trong các
giống dứa chính, cây dứa Cayenne được trồng rất phổ biến. Tuy nhiên, cây dứa
Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hoại, đặc biệt là khả năng
nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá rất cao. Bệnh héo đỏ đầu lá là một bệnh nghiêm trọng nhất
của cây dứa, bệnh xuất hiện phổ biến ở các vùng trồng dứa trên thế giới (Hu và
Ullman, 1996). Tác hại của bệnh là làm suy thoái toàn bộ cây bởi hệ thống rễ bị hư
hại, bề mặt lá bị đỏ vàng, đầu lá bị uốn cong và héo. Do đó, cây dứa tăng trưởng kém,
trái teo nhỏ, không thành thương phẩm. Bệnh do virus PMWaV (Pineapple mealybug
wilt – associated virus) gây ra, thuộc họ Closteroviridae, giống Vinivirus (Sether và
Hu, 2002), chúng mang bộ mã di truyền là sợi đôi RNA. PMWaV có hai loài khác
nhau gây bệnh trên cây dứa là PMWaV-1 và PMWaV-2. Tuy nhiên, nhiều cây dứa
mang mầm PMWaV nhưng không biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài, cây vẫn phát
triển bình thường, gây khó khăn trong việc nhận dạng và phát hiện bệnh này. Hiện
nay, phương pháp RT-PCR (Reverse Trascription – Polymerase Chain Reaction) và
TBIA (Tissue Blot Immunoassay) được sử dụng để phát hiện chính xác cây bệnh
(Sether và cs, 2001).
Để cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn thì cây giống phải
được kiểm tra để đảm bảo chất lượng và sạch bệnh trước khi cung cấp cho các khu vực
trồng dứa. Với đề tài “Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus PMWaV-1 gây
bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne”, chúng tôi hy vọng góp phần cung cấp cây
giống sạch bệnh và có khả năng kháng virus PMWaV-1 cho các khu vực trồng dứa.
1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài
Mục đích
Kiểm tra virus PMWaV-1 ở cây dứa Cayenne nhằm cung cấp cây giống sạch bệnh
và có khả năng kháng virus gây bệnh héo đỏ đầu lá cho các khu vực trồng dứa.


2

Yêu cầu
- Ly trích RNA tổng số từ mẫu dứa.
- Thực hiện phản ứng RT-PCR với RNA ly trích được.
- Khảo sát sự tăng truởng của cây dứa in vitro sạch virus PMWaV-1 và các cây dứa
nhân giống vô tính khác trong vườn ươm.
1.3. Giới hạn của đề tài
Do hạn chế về thời gian và kinh phí nên đề tài chỉ kiểm tra PMWaV-1, chưa kiểm
tra được PMWaV-2 cho số mẫu thí nghiệm.





















3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Đặc điểm thực vật học của cây dứa
Rễ
Rễ dứa là các rễ phụ phát sinh từ mô mạch ở giữa trung trụ và vỏ, đồng thời có rễ
thứ cấp mọc ra từ các rễ trên.
Rễ dứa thường ăn nông, hầu hết ở độ sâu 0 – 15 cm, nếu đào sâu hơn 15 – 30 cm
thì có vài rễ. Rễ có thể mọc dài 2 m nếu điều kiện thuận lợi.
Thân
Thân dứa có dạng chùy, dài 25 – 30 cm, đường kính 2,5 – 3,5 cm. Gốc có thể to
6,5 cm. Thân sinh ra các rễ phụ.
Lá
Cây trưởng thành có 30 – 70 – 80 lá tùy giống. Lá xếp thành hình hoa thị. Lá non ở
giữa, lá già ở xung quanh. Từ dưới lên các lá phân bố xoắn ốc.
Phiến lá hình lòng máng dựng, hứng nước mưa chảy về gốc. Mặt lá có lớp cutin
chống bốc hơi nước, lỗ thoát hơi nước lõm sâu. Các đặc điểm trên giúp cây dứa có khả
năng chịu hạn.
Hoa, quả
Mô phân sinh đỉnh thường sinh ra lá. Đến một lúc nào đó, nó co ngắn lại và phình
ngang rồi phân hóa cuống hoa và dãy mắt hoa; tiếp tục hình thành hoa tự có 8 vòng
hoa. Số hoa trong từng vòng khác nhau. Việc phân chia tế bào hoàn thành về số lượng
trước khi hoa nở. Sau này, quả lớn lên là do tế bào phình to ra và tích lũy chất khô. Sau
khi thụ phấn, nhị, vòi nhụy và cánh hoa tàn lụi; còn lại tất cả các bộ phận khác đều góp
phần tạo ra quả đơn tính. Thịt quả là do mô ở gốc lá bắc, gốc lá đài, mô gốc nhụy phát
triển thành. Quả có mắt dẹt, chén hoa nông thì gọt vỏ ít hao thịt quả. Quả có mắt lồi,
chén hoa sâu, rãnh sâu thì gọt vỏ hao nhiều thịt quả. Lõi quả thực chất là trục hoa tự.
Đỉnh chùm hoa tự có một ngọn gọi là chồi ngọn.
Chồi
Cây dứa có các loại chồi sau đây:
Chồi ngọn phát triển trong suốt quá trình hình thành quả. Nó ngủ nghỉ khi quả
chín, sau đó lại làm chồi con giống.

Xem chi tiết: Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa cayenne